Phương pháp tiêu hóa Collagenase - nuôi cấy tế bào gốc trung mô dây rốn

Tế bào gốc trung mô dây rốn của con người có khả năng biệt hóa cao, gen ổn định, không dễ bị đột biến, không gây khối u; chúng không yêu cầu phải khớp và không bị đào thải, được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh và nghiên cứu chống lão hóa. Hiện nay, việc ứng dụng trong ngành làm đẹp và cho các nhóm phụ về sức khỏe cũng ngày càng thu hút được nhiều sự quan tâm.

Dây rốn của tế bào gốc trung mô dây rốn bao gồm vỏ, kẹo cao su Huatong, tĩnh mạch rốn và động mạch rốn. Tế bào gốc trung mô dây rốn có trong kẹo cao su của Huatong.
Do số lượng nhỏ nên số lượng tế bào thu được sau khi tiêu hóa bằng collagenase cũng ít. Ngoài ra, khi thu được collagen bằng phương pháp tiêu hóa collagenase thông thường, collagenase sẽ có hại cho tế bào hơn và tế bào nuôi cấy ở trạng thái kém.

Phương pháp vá là phương pháp được sử dụng phổ biến để nuôi cấy tế bào trung mô dây rốn của con người nhưng tế bào sẽ bò ra khỏi mô trong thời gian dài (10-20 ngày hoặc thậm chí lâu hơn). Sau khi không ngừng tìm tòi, chúng tôi đã tìm ra cách thu được tế bào gốc trung mô dây rốn bằng phương pháp tiêu hóa collagenase.

Phương thức hoạt động cụ thể như sau:
1 Sau khi cắt dây rốn của bé và dây rốn của mẹ, hãy kẹp ngay bằng kẹp dây rốn để tránh nhiễm bẩn bên trong. Cho vào túi (hộp) vô trùng và chuyển đến phòng thí nghiệm.
2 Trong tủ an toàn sinh học hoặc trên ghế sạch, tháo dây rốn và dùng cồn 75% ngâm trong 2 phút (ống ly tâm 50ml hoặc đĩa 250px). Nếu dây rốn dài không thể bỏ vào thùng thì có thể cắt dây rốn khoảng 250px nhưng phải kẹp thêm kẹp dây rốn trước khi cắt để tránh rượu vào dây rốn làm hỏng tế bào.
3 Sau khi xử lý bằng cồn, nhanh chóng chuyển mẫu vào hộp chứa đầy PBS hoặc nước muối trong 2 lần, mỗi lần 2 phút.
4. Cắt kẹp dây rốn, cắt dây rốn thành các đoạn có kích thước 2-75px, dùng kéo cắt dây rốn từ phía trong của tĩnh mạch rốn, dùng bọ cạp (mô dây rốn tương đối trơn, có bọ cạp để mổ) vào tĩnh mạch rốn, động mạch rốn và dây rốn. Phong bì được loại bỏ để ngăn chặn sự kết hợp của các tế bào linh tinh.
5 Cắt mô dây rốn bằng kéo, pha loãng 0,1% collagenase loại II (dung dịch pha loãng với DMEM/F12) qua đêm và tiêu hóa qua đêm ở 4°C.
6 Ngày hôm sau, đổ mô chưa tiêu lên lưới thép 100 lưới (80 lưới, 160 lưới) (tốt nhất là lưới thép, mang theo một lượng lớn mô để dễ thao tác), rửa bằng PBS (hoặc nước muối) nhiều lần để loại bỏ càng nhiều collagenase càng tốt khỏi bề mặt mô. Cuối cùng, rửa sạch bằng môi trường hoàn chỉnh 1-2 lần để loại bỏ PBS (hoặc nước muối).
7 Đổ ra đĩa (không tiện cho vào chai), thêm một lượng nhỏ môi trường nuôi cấy lên khối mô chưa tiêu (6ml cộng 2-3ml, 10ml cộng 3-4ml) (mục đích là giảm lượng collagenase còn sót lại trên tế bào) gây tổn thương). Ngày hôm sau, khối mô biến mất hoàn toàn (colagenase ngâm trong mô đã được tiêu hóa), các tế bào phân tán hoàn toàn và dưới kính hiển vi, có rất nhiều tế bào phân tán trong mô đã được tiêu hóa. Một lượng nhỏ môi trường (150 px cộng 2-3 ml, 250 px cộng 4-5 ml) được thêm vào môi trường và tiếp tục nuôi cấy.
8 Sau hai ngày, tiếp tục thêm một lượng nhỏ vừa (150px cộng với 2-3ml, 250px cộng với 4-5ml).
9 Sau 1 hoặc 2 ngày, số lượng tế bào sẽ tăng lên đáng kể (phát triển nhiều khuẩn lạc), chuyển vào 2 ống ly tâm 50ml, thêm PBS (hoặc nước muối sinh lý) vào 50ml, trộn đều, ly tâm 2500 vòng/phút, 6 phút.
10 Hòa lại 5-6 ml (tùy thuộc vào lượng tế bào) vào môi trường hoàn chỉnh, ly tâm ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 6 phút, đặt vào bình T25 và thêm 5 ml môi trường hoàn chỉnh.
Sau 13 ngày, có thể tiếp tục nuôi cấy bằng cách thay đổi môi trường hoặc thêm 3-4 ml môi trường hoàn chỉnh. Sau mỗi ba ngày, thay chất lỏng cho đến khi hết (có thể truyền lại hơn 70%)

Ghi chú mặc khải:
1 Phương pháp này dễ thực hiện và có thời gian ủ ngắn.
2 Quá trình tiêu hóa dây rốn bằng collagenase, ở nhiệt độ 37°C, về cơ bản dây rốn có thể được tiêu hóa trong vòng vài giờ, nhưng đồng thời tổn thương tế bào cũng lớn hơn. Collagenase có thể xâm nhập vào mô dây rốn và mô tiêu hóa collagenase nồng độ thấp từ trong ra ngoài, ít gây tổn thương tế bào. (Trypsin có tác dụng tiêu hóa rất kém đối với mô dây rốn)
3 Sở dĩ tiêu hóa hoàn toàn mô và không tách tế bào riêng biệt là do thành phần collagen rốn (chất nhớt) thúc đẩy sự tăng sinh của tế bào gốc trung mô dây rốn. Hầu hết các tế bào lơ lửng trong collagen và sinh sôi nảy nở thành từng cụm, đó là lý do chính khiến các tế bào được giữ ở tình trạng tốt.
4 Khi nuôi cấy tế bào gốc trung mô dây rốn không sử dụng môi trường chứa huyết thanh (huyết thanh thúc đẩy quá trình biệt hóa tế bào) mà sử dụng môi trường đặc hiệu tế bào gốc. Việc đi qua cũng cố gắng không để trypsin tiêu hóa (trypsin làm tổn thương tế bào gốc trung mô dây rốn), nên dùng loại nước tiêu hóa đặc biệt để đảm bảo thời gian đi qua nhiều hơn.