Phân lập tế bào đuôi gai PriCells-Chuột lách-Tiêu hóa Collagenase để chuẩn bị huyền phù tế bào lá lách
Chương trình phụ trợ:
Chuẩn bị huyền phù tế bào lách bằng cách tiêu hóa collagenase
Vật liệu thí nghiệm:
1. 4000U/ml collagenase D, đun chảy và đặt trên đá
2. HBSS, tiệt trùng, chứa Ca + , Mg 2+ (mua tại Life Technologies)
3. Chuột lách
4. Kim tiêm dưới da, đường kính 22G × 1 1/2 (Becton Dickinson)
5. Ống tiêm dùng một lần 10ml, 5ml (như Becton Dickinson)
6. Đĩa petri đường kính 100mm (ví dụ Falcon)
7. Giải phẫu răng cưa của 2 nồi hấp (ví dụ Roboz)
8. Lưới inox hấp: Cắt tấm lưới inox 40 thành các hình vuông nhỏ 5cm × 5cm, gập các mép xuống rồi uốn bốn cạnh thành một cái bát hình chữ nhật nông; giấy bạc được bọc và hấp khử trùng.
phương pháp thí nghiệm:
1. Pha loãng 2 ống 1 ml collagenase D 4000 U/ml (đủ cho 20 lá lách): 1 ml HBSS 9 ml (pha loãng thành 4000 U/ml, bước 8), 1 ml HBSS 39 ml (pha loãng thành 100 U/) Ml). Đặt trên băng.
2. Gắn kim 22G vào ống tiêm 10 ml chứa đầy collagenase 100 U/ml. 10 ml dung dịch 100 U/ml được thêm vào đĩa Petri 100 mm.
3. Lấy một đĩa petri có đường kính 100mm khác để vận hành. Giữ kẹp bằng một tay, tay kia là ống tiêm và ngón cái đặt trên pít-tông. Lá lách của chuột được kẹp bằng kẹp, dùng kim đâm vào cạnh hẹp của nang lá lách và tiêm 100 ml collagenase 100 U/ml. Dùng kẹp đẩy lá lách về phía kim và đưa kim tiến thêm vài mm. Collagenase được tiêm nhiều lần và tiếp tục cho đến khi 1 ml collagenase được tiêm vào lá lách và kim đâm vào lá lách từ đầu bên kia.
4. Dùng kim xé lá lách và chuyển vào đĩa Petri có chứa collagenase (Bước 2). Lặp lại cho đến khi tất cả lá lách được tiêm và rách.
5. Thu huyền phù tế bào từ đĩa thứ hai và cho vào ống ly tâm 50 ml đặt trên đá. Đĩa được rửa bằng 3 ml collagenase 100 U/ml và thêm vào ống ly tâm 50 ml ở trên.
6. Thêm 3 ml collagenase 100 U/ml vào đĩa Petri. Lá lách đã được cắt nhỏ lần lượt được chuyển sang đĩa Petri. Dùng 2 nhíp xé chúng thành những mảnh nhỏ 1 mm ở một bên để có thể đi qua đường kính trong của pipet 5 ml. Sau khi tất cả các lá lách được cắt nhỏ, dung dịch collagenase trong đĩa petri trước đó đặt trên các mảnh lá lách được thêm vào và thổi mạnh nhiều lần bằng pipet 5 ml.
7. Nghiêng đĩa Petri, loại bỏ các mảnh vụn lớn và chuyển huyền phù tế bào vào ống ly tâm 50 ml đặt trên đá ở bước 5. Đĩa được rửa bằng vài ml collagenase 100 U/ml và thêm vào ống ly tâm.
8. Thêm 10 ml collagenase 400 U/ml vào các miếng lách còn lại trong đĩa. Sau khi hút vài lần, đặt vào tủ ấm trong 30-90 phút.
9. Ở giai đoạn ủ cuối cùng, đập vỡ các mảnh và hút chúng vào lưới thép vô trùng có đường kính 100 mm trên đĩa Petri.
10. Cố định một đầu của giấy nến bằng nhíp, rửa các mảnh bằng vài ml collagenase 100 U/ml, sau đó nghiền các mảnh bằng ống tiêm 5 ml vô trùng. Đập cho đến khi loại bỏ hết chất màu đỏ ra khỏi khăn giấy. Lưới thép được rửa bằng vài ml collagenase 100 U/ml.
11. Lấy giấy nến ra khỏi đĩa Petri và loại bỏ các hạt dính không màu. Chất lỏng trong đĩa Petri được thổi mạnh và chuyển sang ống ly tâm 50 ml ở bước 7. Đĩa được rửa bằng vài ml collagenase 100 U/ml và thêm vào ống ly tâm (khoảng 0,5% tế bào đuôi gai hoặc ít hơn).
12. Nếu cần, ly tâm bằng BSA mật độ cao.
phụ lục:
Hồng cầu cừu kết hợp kháng thể (EA):
2,5 ml hồng cầu cừu thu được (chiết xuất trong dung dịch Alsever; Cocalico) được rửa 3 lần bằng PBS và ly tâm ở tốc độ 350 g trong 5 phút sau mỗi lần rửa. Sau đó nó được pha loãng thành huyền phù tế bào 5% ( 10,9 tế bào/ml) bằng PBS mới. Huyết thanh kháng hồng cầu của thỏ có độ nhạy cao được pha loãng theo tỷ lệ 1:50 trong huyền phù tế bào 5% (có thể tạo thành liều kháng thể bị ngưng kết). Ủ trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng và thỉnh thoảng đảo ngược nhẹ dung dịch. EA được hình thành được rửa 3 lần bằng RPMI 1640 (Life Technologies), và sau đó EA được pha loãng thành huyền phù tế bào 5% bằng PBS. Bảo quản ở nhiệt độ 4°C trong 2 tuần và rửa một lần bằng RPMI trước khi sử dụng.
Môi trường hoàn chỉnh RPMI-5:
Môi trường RPMI1640 (Life Technologies), chứa:
5% FBS, bất hoạt nhiệt ở 56°C trong 1 giờ
10mmol/L HEPES
20mg/ml gentamicin sulfat (Life Technologies)
50 mmol/ml 2-ME
Lọc khử trùng
Giải pháp BSA mật độ cao:
Trong bình định mức 1 L, thêm 186 ml PBS, 29 ml NaOH 1 mol/L, 65 ml nước (cẩn thận, chú ý đến chất lỏng và không bắn vào bên trong chai). Không khuấy, bôi 106g BSA (Cohn phần V, BSA đầy đủ khuyến nghị) lên bề mặt dung dịch, phủ giấy thiếc và để lạnh qua đêm để BSA hòa tan từ từ.
Ngày hôm sau lắc nhẹ đã chuyển thành dung dịch trong, hơi nâu; chiết suất được đo đến chữ số thập phân thứ tư gần nhất. Mật độ chính xác của BSA (1,080 g/ml) có chiết suất từ 1,384 đến 1,385 ở 25 °C. Sau khi hiệu chỉnh chỉ số khúc xạ, độ pH được đo bằng giấy thử. Độ pH phải nằm trong khoảng từ 7,0 đến 7,4 và thường không cần điều chỉnh.
Dung dịch lọc vô trùng. Bộ lọc 47 mm (loại Millpore) được đặt phía trên bộ lọc 500 ml (Nalgene #156-4045) và bộ lọc được làm ướt bằng một lượng nhỏ BSA. Lọc chân không trong vài phút cho đến khi BSA được lọc hết. Tháo bơm chân không và cẩn thận thêm dung dịch BSA còn lại vào bình chứa ở phần trên của bộ lọc (tránh tạo bọt. Sử dụng bơm chân không và bộ lọc để lọc lượng BSA còn lại, ≥ 10 phút). Nó có thể được lưu trữ trong 3 tháng ở 4 ° C.
Sichuan Yuanda Shuyang Pharmaceutical Co., Ltd.
