Hướng dẫn sử dụng Kit ELISA Rat Collagenase I

Hướng dẫn sử dụng Kit ELISA Rat Collagenase I

Bộ này chỉ dùng cho nghiên cứu in vitro, không dùng để chẩn đoán lâm sàng!

Ứng dụng dự định

Phương pháp ELISA được sử dụng để xác định định lượng hàm lượng Collagenase I trong huyết thanh chuột, huyết tương hoặc các dịch sinh học liên quan khác.

Nguyên lý thí nghiệm

Phủ tấm microwell bằng kháng thể collagenase I tinh khiết để tạo thành chất mang pha rắn. Lần lượt thêm các mẫu hoặc chất chuẩn, kháng thể collagenase I đánh dấu biotin và avidin đánh dấu HRP vào các vi giếng, sau khi rửa kỹ Sự phát triển màu sắc bằng chất nền (TMB). TMB được chuyển thành màu xanh lam dưới sự xúc tác của peroxidase và thành màu vàng cuối cùng dưới tác dụng của axit. Độ sâu màu có mối tương quan thuận với collagenase I trong mẫu. Đo độ hấp thụ (giá trị) ở bước sóng 450nm bằng đầu đọc vi bản để tính nồng độ mẫu.

Thành phần kit và chuẩn bị thuốc thử

1. Đĩa vi thể: 1 mảnh (96 giếng)

2. Sản phẩm tiêu chuẩn (sản phẩm đông khô): 2 chai, vui lòng chuẩn bị trong vòng 15 phút trước khi sử dụng. Mỗi chai được pha loãng thành 1ml với chất pha loãng mẫu. Sau khi đóng nắp, để yên ở nhiệt độ phòng trong khoảng 10 phút. Đồng thời, nó được đảo ngược/xoa nhiều lần để giúp hòa tan. Nồng độ của nó là 100 ng / ml. Thực hiện nhiều độ pha loãng trong đĩa) và chuẩn bị 100 ng / ml, 50 ng / ml, 25 ng / ml, 12,5 ng / ml, 6,25 ng / ml, 3,12 ng / ml, 1,56 ng / ml và pha loãng mẫu trực tiếp 0 ng / ml dưới dạng giếng trắng. Ví dụ, để chuẩn bị chất chuẩn 50 ng / ml: lấy 0,5ml (không nhỏ hơn 0,5ml) chất chuẩn 100ng / ml trên cho vào ống Eppendorf chứa 0,5ml chất pha loãng mẫu, trộn đều và phần còn lại của nồng độ có thể được suy ra bằng cách tương tự.

3. Dung dịch pha loãng mẫu: 1 × 20ml.

4. Dung dịch thử A: 1 × 10ml.

5. Dung dịch thử B: 1 × 10ml.

6. Dung dịch phát hiện A: 1 × 120 mỗi chai (1: 100). Trước khi sử dụng, pha loãng với Test Diluent A 1: 100 (ví dụ: 10 Test Solution A/990 Test Diluent A), trộn đều và chuẩn bị theo tổng lượng tính toán trước cần thiết cho mỗi thí nghiệm (100 / Hole), nên chuẩn bị thêm 0,1-0,2ml trong quá trình chuẩn bị thực tế.

7. Dung dịch phát hiện B: 1 × 120 mỗi chai (1: 100). Pha loãng 1:100 bằng dung dịch thử nghiệm B ngay trước khi sử dụng. Phương pháp pha loãng tương tự như dung dịch thử A.

8. Dung dịch cơ chất: 1×10ml/chai.

9. Nước rửa đậm đặc: 1×30ml/chai, mỗi chai được pha loãng 25 lần bằng nước cất.

10. Dung dịch dừng: 1×10ml/chai (2 mol/L H2SO4).

11. Cán màng: 5 tờ

12. Sách hướng dẫn: 1 bản

Mang theo vật dụng của riêng bạn

1. Đầu đọc vi bản (Nên làm nóng thiết bị trước khi sử dụng)

2. Thiết bị định lượng vi mô và đầu pipet, ống EP

3. Nước cất hoặc nước khử ion, giấy lọc

Thu thập và bảo quản mẫu vật

1. Huyết thanh: Nên để mẫu máu toàn phần ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ hoặc 4 qua đêm. Sau khi ly tâm ở 1000 g trong 20 phút, lấy phần nổi phía trên để phát hiện hoặc bảo quản phần nổi phía trên ở -20 hoặc -80, nhưng tránh đóng băng và tan băng nhiều lần. .

2. Huyết tương: EDTA hoặc heparin có thể được sử dụng làm thuốc chống đông máu. Ly tâm mẫu ở 1000 g trong 15 phút trong vòng 30 phút sau khi lấy mẫu. Chất nổi phía trên có thể được lấy để phát hiện, hoặc chất nổi phía trên phải được bảo quản ở -20 hoặc -80, nhưng đông lạnh và tan băng nhiều lần.

3. Các mẫu sinh vật khác: ly tâm ở 1000 g trong 20 phút, lấy phần nổi phía trên để xét nghiệm hoặc bảo quản phần nổi phía trên ở -20 hoặc -80, nhưng tránh đóng băng và rã đông nhiều lần.

Lưu ý: Các mẫu trên phải được niêm phong và bảo quản, 4 mẫu nên bảo quản dưới 1 tuần, -20 không quá 1 tháng, -80 không quá 2 tháng; mẫu máu tan sẽ ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm cuối cùng, vì vậy không nên xét nghiệm mẫu máu tan.

bước

Trước khi bắt đầu thí nghiệm, tất cả thuốc thử phải được cân bằng ở nhiệt độ phòng và không được hòa tan trực tiếp thuốc thử ở 37; khi chuẩn bị thuốc thử hoặc mẫu phải được trộn kỹ và cố gắng tránh tạo bọt khi trộn. Nội dung mẫu phải được dự đoán trước khi thử nghiệm. Nếu nồng độ mẫu quá cao, cần pha loãng mẫu để mẫu pha loãng đáp ứng phạm vi phát hiện của bộ sản phẩm, sau đó nhân với hệ số pha loãng tương ứng khi tính toán.

1. Thêm mẫu: đặt lỗ trống, lỗ tiêu chuẩn và lỗ mẫu sẽ được kiểm tra tương ứng. Thêm 100% chất pha loãng mẫu vào giếng trắng và 100% chất chuẩn hoặc mẫu cần thử vào giếng còn lại. Hãy cẩn thận để không có bọt khí. Thêm mẫu vào đáy đĩa enzyme khi thêm mẫu. Cố gắng không chạm vào thành giếng. Đậy hoặc đậy tấm mục tiêu và ủ ở 37 trong 2 giờ. Để đảm bảo kết quả thực nghiệm là hợp lệ

Đối với mỗi thí nghiệm, vui lòng sử dụng một giải pháp tiêu chuẩn mới.

2. Đổ bỏ chất lỏng và lau khô mà không cần giặt. Thêm 100 dung dịch làm việc của dung dịch phát hiện A (đã chuẩn bị trước khi sử dụng) vào từng giếng, thêm đĩa vi thể vào màng và ủ ở 37 trong 1 giờ.

3. Đổ chất lỏng vào lỗ, vắt khô, rửa đĩa 3 lần, ngâm mỗi lần 1-2 phút, khoảng 400 mỗi lỗ, vắt khô (bạn cũng có thể thấm khô chất lỏng trong lỗ).

4. Thêm 100% dung dịch làm việc của dung dịch thử B (đã chuẩn bị trước khi sử dụng) vào từng giếng, thêm lớp phủ và ủ ở 37 trong 1 giờ.

5. Đổ chất lỏng vào lỗ, vắt khô, rửa đĩa 5 lần, thực hiện tương tự như bước 3.

6. Thêm dung dịch cơ chất 90 vào mỗi giếng, tấm nhãn enzyme và màng 37 để tránh hiện tượng phát màu (thời gian phản ứng được kiểm soát ở mức 15-30 phút, khi 3-4 giếng đầu tiên của giếng tiêu chuẩn có gradient màu xanh rõ ràng, 3 giếng cuối cùng -Khi gradient của 4 giếng không rõ ràng, có thể chấm dứt phản ứng).

7. Thêm dung dịch dừng 50% vào từng giếng để dừng phản ứng. Lúc này, màu xanh chuyển sang màu vàng. Thứ tự thêm dung dịch dừng phải giống như thứ tự thêm dung dịch cơ chất.

8. Đo ngay mật độ quang (giá trị) của từng giếng bằng đầu đọc vi bản ở bước sóng 450nm.

Ghi chú:

1. Chuẩn bị thuốc thử: Tất cả thuốc thử phải được cân bằng ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. Vui lòng bảo quản thuốc thử theo hướng dẫn ngay sau khi sử dụng. Vui lòng sử dụng các mẹo dùng một lần trong quá trình thí nghiệm để tránh lây nhiễm chéo.

2. Thêm mẫu: khi thêm mẫu hoặc thêm thuốc thử, nếu khoảng thời gian giữa giếng đầu tiên và giếng cuối cùng quá lớn sẽ dẫn đến thời gian "ủ trước" khác nhau, điều này rõ ràng sẽ ảnh hưởng đến độ chính xác và độ lặp lại của giá trị đo được. Thời gian thêm một mẫu (bao gồm mẫu chuẩn và tất cả các mẫu) được kiểm soát tốt nhất trong vòng 10 phút. Nên bố trí nhiều lỗ để thí nghiệm.

3. Ủ: Để tránh mẫu bay hơi, đặt đĩa có nắp hoặc màng có dán enzyme vào hộp ướt trong quá trình thí nghiệm để tránh chất lỏng bay hơi; bước tiếp theo phải được thực hiện càng sớm càng tốt sau khi rửa tấm, và nên tránh bất cứ lúc nào Tấm vi mô đang ở trạng thái khô; đồng thời, phải tuân thủ nghiêm ngặt thời gian và nhiệt độ ủ nhất định.

4. Rửa: Chất lỏng rửa còn lại trong giếng phản ứng trong quá trình rửa phải được thấm khô trên giấy lọc. Không cho giấy lọc trực tiếp vào giếng phản ứng để hút nước. Đồng thời, cần loại bỏ chất lỏng và dấu vân tay còn sót lại ở đáy tấm để tránh ảnh hưởng đến việc đọc nhãn enzyme cuối cùng của dụng cụ.

5. Chuẩn bị thuốc thử: trước khi sử dụng, vui lòng lắc tay vài lần hoặc ly tâm một lúc để tránh chất lỏng trên thành ống hoặc nắp chai lắng xuống đáy ống. Sản phẩm chuẩn, dung dịch làm việc A và dung dịch làm việc B phải được chuẩn bị theo lượng yêu cầu và pha với chất pha loãng tương ứng, không được nhầm lẫn. Vui lòng chuẩn bị chính xác dung dịch chuẩn và dung dịch làm việc, đồng thời cố gắng không chuẩn bị với số lượng nhỏ (chẳng hạn như khi rút dung dịch thử A, mỗi lần không được nhỏ hơn 10) để tránh sai số nồng độ do pha loãng không chính xác; không sử dụng lại dung dịch làm việc của dung dịch chuẩn và dung dịch thử A đã pha loãng, chất lỏng làm việc của dung dịch phát hiện B.

6. Kiểm soát thời gian phản ứng: Vui lòng quan sát kỹ sự thay đổi màu sắc của phản ứng sau khi thêm chất nền (ví dụ: cứ sau 10 phút). Nếu màu tối, vui lòng thêm trước dung dịch dừng để dừng phản ứng nhằm tránh phản ứng quá mạnh và ảnh hưởng đến đầu đọc vi đĩa. Đọc mật độ quang học

7. Chất nền: Vui lòng giữ chất nền tránh ánh sáng và tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mạnh trong quá trình bảo quản và ủ.

Phương pháp giặt

1. Phương pháp rửa đĩa thủ công: Bơm ít nhất 0,4ml dung dịch đệm rửa được khuyến nghị vào giếng, ngâm trong 1-2 phút, hút (không chạm vào thành đĩa) hoặc rũ bỏ chất lỏng trong đĩa enzyme, đặt một vài lớp lên bàn thí nghiệm. Giấy thấm, úp tấm microtiter xuống và vỗ mạnh vài lần; lặp lại quá trình này nhiều lần nếu cần.

2. Rửa đĩa tự động: Nếu có máy rửa đĩa tự động thì nên sử dụng trong quá trình thí nghiệm chính thức sau khi đã sử dụng thành thạo.

Tính đặc hiệu

Bộ dụng cụ này có thể phát hiện đồng thời collagenase I của chuột tái tổ hợp hoặc tự nhiên và không có phản ứng chéo với các protein liên quan khác.

Tính toán

Mỗi giá trị chuẩn và mẫu được trừ khỏi giá trị lỗ trống (sơ đồ 7 điểm). Nếu đặt nhiều lỗ thì nên sử dụng giá trị trung bình để tính toán. Lấy nồng độ của sản phẩm chuẩn làm tọa độ logarit và giá trị làm tọa độ logarit, vẽ đường cong chuẩn trên giấy tọa độ logarit. Nên sử dụng phần mềm tạo đường cong chuyên nghiệp để phân tích, chẳng hạn như đường cong chuyên gia 1.3, theo giá trị mẫu, tìm nồng độ tương ứng từ đường cong chuẩn và nhân với hệ số pha loãng; hoặc sử dụng nồng độ và giá trị của chất chuẩn để tính phương trình hồi quy của đường chuẩn, sau đó thay giá trị của mẫu vào phương trình, tính nồng độ của mẫu rồi nhân với hệ số pha loãng, là nồng độ thực tế của mẫu.

Phạm vi phát hiện: 1,56 ng/ml-100 ng/ml, vui lòng vẽ các giá trị nồng độ sau để vẽ đường chuẩn: 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,12 ng/ml, 1,56 ng/ml.

Giới hạn phát hiện tối thiểu: 0,78 ng/mL

Giải thích

1. Do điều kiện hiện có và trình độ khoa học công nghệ nên không thể tiến hành nhận dạng và phân tích toàn diện tất cả các nguyên liệu thô được cung cấp bởi tất cả các nhà cung cấp,

Sản phẩm này có thể có những rủi ro nhất định về chất lượng và kỹ thuật.

2. Kết quả thí nghiệm cuối cùng có liên quan chặt chẽ đến hiệu quả của thuốc thử, các hoạt động liên quan của người thí nghiệm và môi trường thí nghiệm tại thời điểm đó, hãy chắc chắn

Chuẩn bị đủ mẫu vật để dự phòng.

3. Tránh để thuốc thử tiếp xúc với ánh sáng mạnh trong quá trình bảo quản và ủ. Tất cả các nắp chai thuốc thử phải được đậy kín để tránh bay hơi và nhiễm vi sinh vật, vì sự can thiệp của enzyme phân giải protein sẽ dẫn đến kết quả sai lệch.

4. Bảo quản bộ dụng cụ: Vui lòng bảo quản chất chuẩn, dung dịch phát hiện A và dung dịch phát hiện B ở -20 càng sớm càng tốt sau khi nhận được bộ sản phẩm và bảo quản các thuốc thử còn lại ở mức 4 để bảo quản trong thời gian ngắn và -20 để bảo quản lâu dài. Sau khi mở, tấm vi mạch phải được niêm phong bằng chất hút ẩm và bảo quản ở -20 để tránh ẩm.

5. Muối sẽ được kết tủa từ nước giặt đậm đặc, có thể đun nóng và hòa tan trong nồi cách thủy khi pha loãng.

6. Có thể có một ít chất giống nước trong giếng của tấm liên kết enzyme vừa mở ra. Đây là hiện tượng bình thường và sẽ không có bất kỳ ảnh hưởng nào đến kết quả thí nghiệm.

7. Hiệu lực: 6 tháng.