ELISA Collagenase bò (Collagenase)

October 19, 2024

Hướng dẫn sử dụng bộ sản phẩm

Thuốc thử này chỉ dành cho mục đích nghiên cứu: Bộ dụng cụ này được sử dụng để xác định hàm lượng collagenase trong huyết thanh bò, huyết tương và các mẫu chất lỏng liên quan.

Nguyên tắc thí nghiệm:

Bộ dụng cụ này sử dụng phương pháp kẹp kháng thể kép để xác định mức độ collagenase của bò trong mẫu vật. Phủ tấm vi mạch bằng kháng thể collagenase (Collagenase) tinh khiết của bò để tạo ra kháng thể pha rắn, lần lượt thêm collagenase (Collagenase) vào các vi giếng được phủ kháng thể đơn dòng, sau đó kết hợp với kháng thể Collagenase có nhãn HRP để tạo thành phức hợp kháng thể gắn nhãn kháng nguyên-kháng nguyên và sau khi rửa kỹ, cơ chất TMB được thêm vào để phát triển màu sắc. TMB được chuyển thành màu xanh lam dưới sự xúc tác của enzyme HRP và thành màu vàng cuối cùng dưới tác dụng của axit. Độ sâu màu có mối tương quan thuận với collagenase trong mẫu. Độ hấp thụ (giá trị OD) được đo bằng đầu đọc vi bản ở bước sóng 450nm và nồng độ collagenase của bò (Collagenase) trong mẫu được tính bằng đường cong chuẩn.

Thành phần bộ:

Thành phần bộ

Cấu hình 48 lỗ

Cấu hình 96 giếng

cứu

Hướng dẫn

1 phần ăn

Phim niêm phong

2 cái (48)

2 cái (96)

túi kín

Tấm phủ enzyme

1 × 48

1 × 96

Bảo quản ở 2-8oC

Sản phẩm tiêu chuẩn: 360ng/ml

0,5ml × 1 chai

Bảo quản ở 2-8oC

Pha loãng tiêu chuẩn

1.5ml × 1 chai

Bảo quản ở 2-8oC

Thuốc thử enzyme

3ml × 1 chai

6ml × 1 chai

Bảo quản ở 2-8oC

chất pha loãng mẫu

3ml × 1 chai

6ml × 1 chai

Bảo quản ở 2-8oC

Nhà phát triển A chất lỏng

3ml × 1 chai

6ml × 1 chai

Bảo quản ở 2-8oC

Chất lỏng phát triển B

3ml × 1 chai

6ml × 1 chai

Bảo quản ở 2-8oC

Dừng giải pháp

3ml × 1 chai

6ml × 1 chai

Bảo quản ở 2-8oC

Nước giặt đậm đặc

(20ml × 20 lần) × 1 chai

(20ml × 30 lần) × 1 chai

Bảo quản ở 2-8oC

Yêu cầu và xử lý mẫu:

1. Huyết thanh: máu ở nhiệt độ phòng đông tự nhiên trong 10-20 phút, ly tâm trong khoảng 20 phút (2000-3000 vòng/phút). Thu thập cẩn thận phần nổi phía trên và ly tâm lại nếu xuất hiện kết tủa trong quá trình bảo quản.

2. Huyết tương: EDTA hoặc natri citrate nên được chọn làm chất chống đông máu theo yêu cầu của mẫu vật, trộn trong 10-20 phút và ly tâm trong khoảng 20 phút (2000-3000 vòng / phút). Thu thập cẩn thận phần nổi phía trên. Nếu kết tủa hình thành trong quá trình bảo quản thì phải ly tâm lại.

3. Nước tiểu: cho vào ống vô trùng và ly tâm trong khoảng 20 phút (2000-3000 vòng/phút). Thu thập cẩn thận phần nổi phía trên. Nếu có kết tủa hình thành trong quá trình bảo quản thì ly tâm lại. Màng phổi và cổ trướng, thực hiện tham khảo dịch não tủy.

4. Dịch nổi nuôi cấy tế bào: Khi phát hiện thành phần tiết ra thì thu thập bằng ống vô trùng. Ly tâm trong khoảng 20 phút (2000-3000 vòng/phút). Thu thập cẩn thận phần nổi phía trên. Khi phát hiện các thành phần bên trong tế bào, pha loãng huyền phù tế bào bằng PBS (PH7.2-7.4), nồng độ tế bào sẽ đạt khoảng 1 triệu/ml. Thông qua việc đông lạnh và rã đông lặp đi lặp lại, các tế bào bị phá hủy và các thành phần nội bào được giải phóng. Ly tâm trong khoảng 20 phút (2000-3000 vòng/phút). Thu thập cẩn thận phần nổi phía trên. Nếu kết tủa hình thành trong quá trình bảo quản thì phải ly tâm lại.

5. Sắp xếp mẫu: sau khi cắt mẫu, cân mẫu. Thêm một lượng PBS nhất định, PH7.4. Nhanh chóng đông lạnh và tiết kiệm bằng nitơ lỏng để sử dụng sau. Sau khi mẫu tan chảy, nó vẫn duy trì nhiệt độ 2-8 ° C. Thêm một lượng PBS (PH7.4) nhất định và đồng nhất mẫu bằng tay hoặc máy đồng nhất. Ly tâm trong khoảng 20 phút (2000-3000 vòng/phút). Thu thập cẩn thận phần nổi phía trên. Sau khi chia nhỏ, một phần sẽ được kiểm tra và phần còn lại được đông lạnh để sử dụng trong tương lai.

6. Mẫu vật phải được chiết càng sớm càng tốt sau khi thu thập. Việc chiết xuất phải được thực hiện theo tài liệu liên quan. Thí nghiệm nên được tiến hành càng sớm càng tốt sau khi chiết xuất. Nếu thử nghiệm không thể được thực hiện ngay lập tức, mẫu thử có thể được bảo quản ở -20oC, nhưng nên tránh đóng băng và tan băng nhiều lần.

7. Không thể phát hiện mẫu chứa NaN3 vì NaN3 ức chế hoạt động của peroxidase cải ngựa (HRP).

Các bước:

1. Pha loãng và nạp sản phẩm tiêu chuẩn: đặt 10 giếng tiêu chuẩn trên tấm phủ enzyme, thêm 100 μl sản phẩm tiêu chuẩn vào giếng thứ nhất và giếng thứ hai, sau đó thêm 50μl chất pha loãng vào giếng thứ nhất và giếng thứ hai, trộn đều; sau đó lấy 100μl từ giếng thứ nhất và giếng thứ hai lần lượt thêm vào giếng thứ ba và thứ tư, sau đó thêm 50μl chất pha loãng tiêu chuẩn vào giếng thứ ba và thứ tư tương ứng, trộn đều; Sau đó lấy 50μl mỗi giếng vào giếng thứ ba và thứ tư và loại bỏ, sau đó thêm 50μl mỗi giếng vào giếng thứ năm và thứ sáu, sau đó thêm 50ul dung dịch pha loãng tiêu chuẩn tương ứng vào giếng thứ năm và thứ sáu, rồi trộn đều; Sau khi trộn, lấy 50μl từ giếng thứ năm và thứ sáu và thêm lần lượt vào giếng thứ bảy và thứ tám. Sau đó thêm 50μl dung dịch pha loãng tiêu chuẩn vào giếng thứ bảy và thứ tám tương ứng. Lấy 50μl từ tám giếng và thêm chúng vào giếng thứ chín và thứ mười. Sau đó thêm 50μl dung dịch pha loãng tiêu chuẩn vào giếng thứ chín và thứ mười. Sau khi trộn, lấy 50μl từ giếng thứ chín và thứ mười rồi bỏ đi. (Sau khi pha loãng, thể tích mỗi giếng là 50μl, nồng độ lần lượt là 240ng/ml, 160ng/ml, 80ng/ml, 40ng/ml, 20ng/ml).

2. Thêm mẫu: thiết lập giếng trắng (giếng đối chứng trống không thêm mẫu và thuốc thử enzyme, các bước còn lại giống nhau) và giếng mẫu cần xét nghiệm. Thêm 40μl chất pha loãng mẫu vào giếng mẫu thử của tấm phủ enzyme, sau đó thêm 10μl mẫu cần thử (độ pha loãng cuối cùng của mẫu là 5 lần). Cho mẫu vào và cho mẫu vào đáy giếng của đĩa vi mạch, cố gắng không chạm vào thành giếng, lắc nhẹ để trộn đều.

3. Ủ: Đậy đĩa bằng tấm dán kín và ủ ở 37°C trong 30 phút.

4. Dung dịch pha trộn: Pha loãng 30 lần (20 lần dung dịch 48T) nước rửa đậm đặc với nước cất 30 lần (20 lần dung dịch 48T) rồi sử dụng.

5. Giặt: Cẩn thận bóc màng niêm phong, loại bỏ chất lỏng, vắt khô, đổ đầy nước giặt vào từng giếng, để yên trong 30 giây rồi loại bỏ, lặp lại thao tác này 5 lần, vỗ nhẹ cho khô.

6. Thêm enzyme: thêm 50μl thuốc thử nhãn enzyme vào mỗi giếng, ngoại trừ giếng trắng.

7. Ủ: Thao tác tương tự như 3.

8. Giặt: Thao tác tương tự như bước 5.

9. Hiện màu: thêm 50μl chất phát triển A vào mỗi giếng, sau đó thêm 50μl chất phát triển B, trộn nhẹ nhàng và phát triển ở 37 ° C trong bóng tối trong 15 phút.

10. Chấm dứt: Thêm 50μl dung dịch dừng vào mỗi giếng để dừng phản ứng (lúc này màu xanh sẽ chuyển sang màu vàng).

11. Xác định: Đo độ hấp thụ (giá trị OD) của từng giếng lần lượt bằng máy điều hòa không khí trắng ở bước sóng 0 và 450 nm. Phép đo phải được thực hiện trong vòng 15 phút sau khi thêm dung dịch dừng.

Các biện pháp phòng ngừa:

1. Bộ sản phẩm phải được cân bằng ở nhiệt độ phòng trong 15-30 phút trước khi lấy ra khỏi môi trường lạnh. Nếu tấm phủ nhãn enzyme chưa được mở thì dải này phải được bảo quản trong túi kín.

2. Các tinh thể có thể bị kết tủa trong chất lỏng giặt đậm đặc, chất lỏng này có thể được đun nóng và hòa tan trong bồn nước trong quá trình pha loãng và kết quả sẽ không bị ảnh hưởng trong quá trình giặt.

3. Nên sử dụng dụng cụ lấy mẫu ở mỗi bước thêm mẫu và phải thường xuyên kiểm tra độ chính xác để tránh sai sót trong thử nghiệm. Tốt nhất nên kiểm soát thời gian lấy mẫu trong vòng 5 phút. Nếu có nhiều mẫu thì nên dùng súng chuyền để thêm mẫu.

4. Vui lòng tạo một đường cong tiêu chuẩn tại cùng thời điểm của mỗi lần đo, tốt nhất là tạo một lỗ kép. Nếu hàm lượng chất thử trong mẫu quá cao (giá trị OD của mẫu lớn hơn giá trị OD của giếng đầu tiên của giếng tiêu chuẩn), trước tiên hãy pha loãng nó với bội số (n lần) nhất định của chất pha loãng mẫu và sau đó xác định nó. Khi tính toán hãy nhân tổng độ pha loãng với bội số (× n × 5).

5. Màng niêm phong được giới hạn sử dụng một lần để tránh lây nhiễm chéo.

6. Hãy giữ chất nền tránh xa ánh sáng.

7. Thực hiện đúng hướng dẫn và kết quả kiểm tra phải được xác định bằng máy đọc vi đĩa.

8. Tất cả các mẫu, chất lỏng rửa và các chất thải khác nhau phải được xử lý như tác nhân lây nhiễm.

9. Không được trộn lẫn các thành phần của các lô thuốc thử khác nhau.

10. Nếu có bất kỳ sự khác biệt nào so với hướng dẫn sử dụng tiếng Anh thì hướng dẫn sử dụng tiếng Anh sẽ được ưu tiên áp dụng.

Tính toán:

Lấy nồng độ của chất chuẩn làm trục hoành và giá trị OD làm tọa độ,

Vẽ đường cong chuẩn trên giấy tọa độ, theo OD của mẫu

Giá trị được xác định theo đường chuẩn; sau đó nhân với độ pha loãng

Nhiều; hoặc tính chất chuẩn bằng cách sử dụng nồng độ và giá trị OD của chất chuẩn

Phương trình hồi quy tuyến tính của gần như đường cong, giá trị OD của mẫu